肿瘤的超微结构

（一）电镜诊断的基础知识

1. 电镜与光镜的主要区别 电子显微镜和光学显微镜都是对细胞、组织的形态进行研究的重要工具，但是在结构和成像原理上都不相同。为了更好地利用它们的特点为研究和诊断服务，有必要对它们的差异进行梗概的了解（表3）。

表3 电镜与光镜的主要区别 光镜（LM）透射电镜(TEM)扫描电镜(SEM) 照明可见光电子束电子束 透镜玻璃透镜电磁透镜电磁透镜 分辨率0.5um0.2nm1-10nm 放大倍率40-1000倍 80-100万倍 20-40万倍 景深浅中等深 成像原理光线吸收为主电子散射作用二次电子信息 成像方式直接成像荧光屏成像显像管间接成像 图像颜色彩色黑白黑白 样品环境空气高真空高真空 样品制作较简便复杂较复杂

2.与电镜诊断有关的几个概念

（1）电镜的计量单位：光学显微镜的计量单位为微米，以um来表示，为mm的千分之一；电镜常用的计量单位为纳米（毫微米），以nm来表示，为um 的十分之一。 电镜的另一个长度计量单位为埃（分毫微米）以A 0(angstrom)来表示，为nm 的十分之一，根据国际单位制的规定，目前采用nm 而不用A 0 。 1mm=1000um（微米） 1um=1000nm（纳米） 1nm=A 0（埃 分毫微米）

（2）分辨率：分辨率又称为分辨力和分辨本领，它表示仪器的能力是以清楚分开的两点的最小距离。根据Abbe 公式计算，电子显微镜的分辨力应约为用来作为照明源的电子束波长的一半，即0.005nm/2=0.0025nm，但当前电子显微镜的分辨力仅有0.2nm 左右，比理论值尚差近100 倍。

（3）放大倍率：显微镜的放大倍率与其分辨力密切相关，它是人眼分辨力与显微镜分辨力之比。即：显微镜的放大倍率（m）= 人眼分辨力d/ 显微镜分辨力d，人眼的分辨力一般为0.2mm，所以电镜的放大倍率（m=0.2mm/0.2nm=1000000 倍（100 万× ）

3 .透射式电子显微镜 透射式电子显微镜简称透射电镜。利用磁透镜对穿过样品的电子束进行放大，这种电子束带有样品中的超微结构信息，可以在荧光屏上显示超微结构的电子放大图像。它是高性能的大型精密电子光学仪器，它的主要特点是：1)分辨本领高，已接近或达到了仪器的理论极限分辨本领，如最新型号的日立H-9000 型，其点分辨力可达0.18nm；2)放大倍率高，变换范围大，一般从几百倍到数十万倍；3)使用范围广，在医学和生物学方面可用超薄切片和冷冻复型技术制样，直接观察生物组织细胞的形貌结构。

4. 扫描式电子显微镜 扫描式电子显微镜其特点为电子束，在样品表面上动态地扫描，以一定速度一点一点地、成行成帧地扫完待检标本的表面面积，在此范围内样品也一点一点地发出带有形态结构和化学组分信息的二次电子。这些电子被送到检测器，最后在屏幕上形成该范围内的形态画面，在生物学、医学领域内扫描电镜主要用来观察组织、细胞的表面超微结构。

5 .电镜观察用标本制备

（1）透射电镜用超薄切片。

1）取材：“快、准、轻、小”为原则。“快”即取材迅速，使标本在离体0.5-2 分钟内浸入固定液，使受检标本以最大限度地处于生活状态下被固定，以便保存标本的超微结构原貌；“准”即准确可靠地进行定位和定向；“轻”即避免对组织挤压和钳拉，以减少超微结构的人工损伤性变化；“小”即电镜标本固定液穿透力都比较弱，所以标本以1m3 为宜。

2）前固定：以醛类固定液固定标本4 小时以上，使细胞生命活动立即停止，以使其精细结构得以良好保存。

3）后固定：以锇酸后固定标本2 小时内完成。

4）脱水：丙酮或乙醇系列脱水，每级5-15 分钟。

5）浸透：环氧丙烷浸透15-30 分钟，包埋剂浸透过夜。

6）包埋：包埋剂包埋，在600C条件下24-36 小时聚合。

7）切片：以超薄切片机切成50nm 厚的切片。

8）电子染色：醋酸铀染色30-45 分钟，柠檬酸铅复染30 分钟。观察。

（2）扫描电镜观察用生物样品：扫描电镜主要应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察，主要是收集电子束照射在样品上所产生的二次电子。为了增强生物样品的导电性能，提高二次电子发射率及耐受电子轰击的能力，必须对样品进行增加导电性能的处理，目前主要通过金属镀膜和组织导电术进行。

（3）电镜观察用生物样品特殊制备技术

1）冷冻蚀刻技术（冷冻断裂法或冷冻复型法）：样品迅速低温冷冻以保持细胞活体状态，以特殊装置断裂细胞，主要用来研究生物膜结构。

2）冷冻超薄切片技术：与常规超薄切片技术相比，主要区别在于以快速冷冻代替化学固定，同时取消了有机溶剂脱水以及树脂渗透包埋等步骤，主要用以细胞化学、免疫电镜的研究和诊断。

3）放射自显影技术：在待观察标本上涂着感光乳胶，使其中溴化银在标本的核素射线作用下感光。主要用以核酸合成代谢；脂类蛋白质合成、分泌及亚细胞结构与功能的关系。

4）电镜细胞化学技术：将细胞内特定的化学产物形成高电子密度不溶性沉淀物，借助电镜做超微结构的原位分析，这一分析方法对细胞内酶类分布的研究具有特别的优势。

5）电镜免疫细胞化学技术：组织和细胞内多数大分子物质缺乏形态学特征和特异性组织化学反应，但这类大分子物质多具有抗原性。利用抗原抗体特异性结合的原理，在超微水平定性、鉴别和定位，并能在电镜下观察到抗原抗体结合物的存在。

6）X 射线显微分析技术：在电镜内以高速细电子束轰击样品表面的微小区域，使该区域所含元素各自发出特异性8 射线，再以8 线检测装置，分析8 线的波长和能量，进而了解该区域内元素的种类和含量。

二）肿瘤电镜诊断

1. 肿瘤电镜诊断的要点

（1）标本采集要保证“准确”、“新鲜”，最好由专门人员在手术台旁等候。

（2）掌握临床相关资料和手术所见。

（3）制作半薄切片，以便超薄切片定位准确。

（4）熟悉各种组织或细胞的正常超微结构及一般超微结构的病理变化。

（5）避免以一两种超微结构的变化片面诊断。

（6）密切结合光镜所见，综合分析判断。

2. 肿瘤诊断的电镜观察和分析步骤

（1）先低倍总览，高倍细勘。

（2）细胞的外形及细胞间的连结、排列方式。

（3）细胞质内的高尔基复合体、大小泡、分泌颗粒、代谢产物、细丝、微管、中心粒的排列及数量。

（4）胞质中膜系统的改变。

（5）核、核仁及它们的相关结构。

（6）细胞与间质间的关系。

3. 肿瘤细胞的一般超微结构特征

（1）质膜及其特性物

1）细胞外形及质膜：肿瘤细胞在电镜观察下，基本上可分成圆形、梭形、柱形和多形性，细胞膜多不规则，特别是异形性的恶性肿瘤细胞。

2）质膜与质膜间的排列方式可分为：紧密并列、松散交织、平行穿插、交织互扣（脑膜瘤最典型）及同心包裹（少突胶质细胞瘤）多种形式。

3）丝足和片垂：由胞质向外形成的有足突起，较细小者称丝足，较宽大的称片垂，多见于恶性肿瘤，意味着细胞的游走和侵袭。

4）微绒毛：质膜和胞质的细小指状突起，可稀可密，多在细胞的游离缘，微绒毛心内只有无结构的胞质及少许核糖体，少数微绒毛内有纵行的微丝术深入胞质内，称其为丝心微绒毛，多发生在肠、胃腺癌，有时也见于气管或卵巢、子宫颈的粘液癌，有助于鉴别诊断。间毛瘤的微绒毛细长而丰富，具有特征性。

5）纤毛：较微绒毛粗而长，内有9+2 型的微管构成，肿瘤时常以9+0 或其它异形出现。纤毛常出现在甲状腺和女性生殖道的高分化上皮性肿瘤，如甲状腺乳头状癌、卵巢浆液性囊腺癌、子宫内膜癌等。这些类型的低分化癌中，纤毛则大为减少，值得注意的是，与呼吸道上皮有关的癌反而缺乏纤毛。

6）连接：细胞间的连接有无、类型和结构对肿瘤类型的识别非常重要。腺上皮和移行上皮的肿瘤中常可见连接复合体，鳞状上皮的肿瘤具有典型的带张力丝囊的颗粒，紧密相对的细胞质膜出现两侧相对的双线致密，称为中间连接，是间质中的肿瘤标记。

（2）细胞质的超微结构：在电镜的诊断中，细胞质中的分化表型变化对肿瘤的分类、分型起着重要的作用，在很多情况下要比细胞核重要得多。

1）细胞质中的颗粒：种类繁多，可根据其形状、大小、数量及分布特征加以区别分泌性颗粒：垂体腺瘤分泌颗粒可分为五种：GH、PL ACTH、TSH、FSH（LH），各有形态及分布特征。 胰岛细胞瘤分泌颗粒又分高血糖素颗粒和胰岛素颗粒。 神经内分泌颗粒多为圆形，有界膜致密心，结合免疫组化可精确分类。

黑色素颗粒：黑色素前颗粒对黑色素瘤的诊断有决定性价值，而成熟的黑色素颗粒没有特异性，因其可被传递到非黑色素细胞内。

角化透明颗粒：多见于高分化鳞癌的细胞内。 粘液颗粒及原纤维性粘液颗粒：前者多见于产生粘液的腺上皮细胞内，后者则多见于宫颈腺癌。

Weibel-Palade小体：是内皮细胞中的特异性颗粒，见于内皮细胞分化的肿瘤内。

Auer小体：出现于急性原始粒细胞白血病和早幼粒细胞白血病。

溶酶体颗粒：见于单核巨噬细胞的肿瘤及颗粒细胞瘤内。

前列腺颗粒：特异性地出现在前列腺癌细胞内。

2）微丝：可根据直径分为三种类型。

细微丝：直径5-7nm，长1um，因其成分主要是肌动蛋白，所以肌动蛋白微丝可出现在各种细胞内。在肌原性细胞内则与粗微丝呈专性耦联存在。 粗微丝：直径10-14nm，长1.5um，成分主要是肌动蛋白，来源于横纹肌的肿瘤内多见。

中间丝：9-12nm，很长，常成囊存在。又可分为张力丝（鳞癌）、胶质丝（星形细胞、少突胶质细胞肿瘤）、神经丝（神经元的肿瘤）等。

3）微管：无特异性诊断意义，具有缺乏、多寡之分，分化低较幼稚的细胞及神经元来源的肿瘤细胞内较多，而尤文瘤中缺如。

4）内质网：肿瘤细胞的内质网要比正常细胞多，特别是分化高的肿瘤要比分化低的肿瘤更为多见。

5）核糖体玫瑰花（多聚核糖体）：与内质网相反，分化较低的肿瘤或生长较快的细胞内核糖体多，而分化高的肿瘤细胞内量很少。

6）高尔基复合体：分化高的肿瘤或分泌旺盛的细胞，高尔基复合体数量多且发育良好，伴有不同程度的扩张，而低分化肿瘤细胞中少见且发育差，不明显。

7）线粒体：形状和大小在不同肿瘤中常有不同程度的变化，在肿瘤的情况下线粒体多，呈肿胀、舒畅性及多样性，甚至可形成分支、新月、环形、巨形等奇异性线粒体。

8）糖原：根据量的多少及排列方式可具有一定的诊断参考价值。如：尤文瘤和软骨来源的肿瘤中糖原都很多，可以聚集成湖。尤文瘤中多分布在核的周围，而软骨来源的肿瘤中多分布在胞质的周边，贴近于胞膜。

（3）细胞核超微结构：在分子水平，肿瘤细胞核是染色体内基因变异的关键，而在亚细胞水平，细胞核很少显示出有重要诊断意义的特异性变化，但下列的变化可具有一定的诊断参考价值。

1）形状：一般而言，恶性肿瘤特别是恶性度高的肿瘤，为了增加核与胞质间的信息或物质交换，核有增加表面积的趋势，表现在形态学方面的变化为核不规则，可以出现裂核、曲核、脑形核、核突、核袋以及放射状节段核。

2）大小：生长活跃的恶性肿瘤核明显增大，核浆比例加大。

3）数目：有些肿瘤可出现多核现象，如有融合趋势或细胞异形性明显的肿瘤。但在核卷曲或多叶核的情况下，从一个剖面看可出现假性多核，故应有三维观的概念。

4）核仁：肿瘤特别是恶性肿瘤，核仁常较大，有时可非常大，称之为牛眼核，核仁数目也常增多，并且常贴于核膜下，轮廓也不规则。

5）染色质：在生长旺盛的肿瘤常染色质增加，异染色质减少，有时在细胞质内可见到染色质团块，说明处在核有丝分裂过程中。

6）核纤维板：核膜与核膜下异染色质之间夹有一厚层原纤维板，通常在无脊椎动物的细胞，如微生物中此板突出，脊椎动物的细胞则不明显，但在人的一些肿瘤中可出现明显的核纤维板。

7）核膜：肿瘤细胞的核膜无特异性改变，有时可见核孔增大，有时却不见核孔。

（4）间质的超微结构：肿瘤的间质中均含有大量的血管和炎性细胞，对诊断没有意义，某些特殊的间质结构对肿瘤的诊断具有相对的参考价值。

1）外板：在高分辨电镜下，在细胞膜外紧接着有一层宽约30nm 的透明带，为细胞衣层，在细胞衣层外方有一均质性致密层，称之为外板。文献中有的称为基膜或基板，但以外板更为确切。细胞的外板由复杂的大分子组成，具有屏障、滤过及胶合的作用。在神经鞘瘤、血管内皮、外皮瘤以及平滑肌瘤的细胞外板明显甚至为多层。另有一些肿瘤的细胞没有外板，有时也是重要的鉴别依据。

2）通常的胶原纤维：直径20-120nm，64nm 横纹周期，多见于中胚层源性肿瘤。

3）巨胶原纤维：直径较通常胶原纤维粗6-10 倍，52-62nm 横纹周期，多见于软骨肉瘤、滑膜肉瘤、雷旺瘤。

4）淀粉样变：由直径8-10nm 细丝构成，细丝不分支，排列随机，无极性，之间有粗大的胶原纤维。常见于淋巴、浆细胞性肿瘤以及产生多肽的内分泌肿瘤，其它肿瘤偶见。

5）成纤维细胞和肌纤维母细胞：二者均为重要的间质细胞成分，肌纤维母细胞是癌发生浸润时的反应，其可引起纤维增生和收缩。

6）弹力纤维：浸润性乳腺癌中多见。许多癌症患者是这样走向康复的: 肝 癌胰腺癌肺 癌 食管癌胃 癌肠 癌 乳腺癌卵巢癌鼻咽癌 白血病脑 瘤肾 癌 膀胱癌淋巴瘤胆囊癌 壶腹癌阴茎癌睾丸癌